問題狀態(tài)
HPLC原理就是利用固定相與流動相的極性的差異,而達(dá)到分散物質(zhì)目的
。(一)有效液相色譜闡發(fā)的流程
由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng),然后輸出,經(jīng)流量與壓力測量之后,導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入,并隨流動相通過色譜柱,在柱上進(jìn)行分散后進(jìn)入檢測器,檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備收羅與處理,并記錄色譜圖
。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分散(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜轉(zhuǎn)變溫度,而HPLC轉(zhuǎn)變的是流動相極性,使樣品各組分在***佳條件下患上以分散
。有效液相色譜法按分散機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)
、離子交換色譜法、離子對色譜法及份子排阻色譜法。1.液固色譜法 使用固體吸附劑,被分散組分在色譜柱上分散原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分散。分散過程是一個吸附-解吸附的平衡過程
。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分散份子量200~1000的組分,大多數(shù)用于非離子型化合物,離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分散同分異構(gòu)體。2.液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面,或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相,分散原理是根據(jù)被分散的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分散
。分散過程是一個分配平衡過程。涂布式固定響應(yīng)具有杰出的惰性;流動相須***預(yù)先用固定相飽和,以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分散和收集復(fù)雜化
。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,現(xiàn)在已很少接納?div id="4qifd00" class="flower right">液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)
正相色譜法 接納極性固定相(如聚乙二醇
反相色譜法 一般用非極性固定相(如C18
、C8);流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙***、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分散非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用***為廣泛,據(jù)統(tǒng)計,它占全般HPLC應(yīng)用的80%擺布。跟著柱填料的快速成長,反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大,現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的闡發(fā)
。為控制樣品在闡發(fā)過程的解離,常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會使硅膠溶解,太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
從上表可看出,當(dāng)極性為中常時正相色譜法與反相色譜法沒有較著的界線(如氨基鍵合固定相)
。3.離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架,在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)
。被分散組分在色譜柱上分散原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換,根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷魔力而分散。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相
。被分散組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分散子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外,它還受流動相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可轉(zhuǎn)變化合物的解離程度,繼續(xù)往前影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大,則離子強(qiáng)度高,不利于樣品的解離,導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于闡發(fā)有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。4.離子對色譜法 又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分散子與離子對試藥離子形成中性的離子對化合物后,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分散效果改善
。主要用于闡發(fā)離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)闡發(fā)堿性物質(zhì)常用的離子對試藥為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等
闡發(fā)酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨
離子對色譜法常用ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的離子對試藥,在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分散。被測組分保時間與離子對性質(zhì)
5.排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動相是可以溶解樣品的溶劑
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
有效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上,引用了氣相色譜的理論,在技能上,流動相改為高壓運送(***高運送壓力可達(dá)4.9′107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器,可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。
特點
1.高壓:液相色譜法以液體為流動相(稱為載液),液體流經(jīng)色譜柱,受到阻力較大,為了迅速地通過色譜柱,須***對載液施加高壓
2. 高速:流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快患上多,一般可達(dá)1～10ml/min。有效液相色譜法所需的闡發(fā)時間較之經(jīng)典液相色譜法少患上多,一般少于 1h
3. 有效:近來研究出很多新型固定相,使分散效率大大提高
4.高靈敏度:有效液相色譜已廣泛接納高靈敏度的檢測器,進(jìn)一步提高了闡發(fā)的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達(dá)10-11g
5.順應(yīng)范圍寬:氣相色譜法與有效液相色譜法的比較:氣相色譜法雖具有分散能力好,靈敏度高,闡發(fā)速度快,操作方便等優(yōu)點,但是受技能條件的限制,沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行闡發(fā)。而有效液相色譜法,只要求試樣能制成溶液,而不需要氣化,因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點
、熱穩(wěn)定性差、相對份子量大(大于 400 以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總額的 75% ～ 80% )原則上都可應(yīng)用有效液相色譜法來進(jìn)行分散、闡發(fā)。 據(jù)統(tǒng)計,在已知化合物中,能用氣相色譜闡發(fā)的約占20%,而能用液相色譜闡發(fā)的約占70～80%。有效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為有效凝膠色譜
有效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)
1.進(jìn)樣系統(tǒng)
一般接納隔閡注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵
3.分散系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱
另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻
再者,有效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,通過改善傳質(zhì)速度,縮短闡發(fā)時間,就可增加層析柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
有效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點:使用面廣(如蛋白質(zhì)
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比
(5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行收羅
- 產(chǎn)品中心
- 食品行業(yè)專用泵 酒精行業(yè)專用泵 化工行業(yè)專用泵 制藥行業(yè)專用泵 環(huán)保行業(yè)專用泵 淀粉行業(yè)專用泵 釀造行業(yè)專用泵 發(fā)酵行業(yè)專用泵 不銹鋼自吸泵 鹽礦專用泵 導(dǎo)熱油泵 磁力泵 屏蔽泵 機(jī)械及釜用機(jī)械密封 薯類成套淀粉設(shè)備 閥門管件及泵易損件
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